مطالعه تنوع ژنتیکی ۲۹ ژنوتیپ مختلف برنج بر اساس صفات گیاهچه ای و …

 
(۲) روشهایی که مبتنی بر مدل[۳۲] هستند، که در آنها فرض بر این است که افراد درون هر خوشه مشاهدات تصادفی از برخی مدلهای پارامتری هستند و همراه با پارامترهای مرتبط با هر خوشه تفسیر میشوند و عضویت خوشهای هر فرد توسط شیوههای استاندارد آماری همانند حداکثر درستنمایی و… صورت میگیرد (پریچارد و همکاران، ۲۰۰۰).
در بین روشهای تجزیه خوشهای، بیشتر از الگوریتمهای مبتنی بر فاصله در تجزیه تنوع ژنتیکی استفاده میشود. روشهای مبتنی بر فاصله به عنوان ورودی مورد تجزیه و تحلیل قرار میگیرند و خروجی به صورت گرافیکی مانند دندروگرام یا به صورت درختی قابل ارائه میگردد.
روشهای مبتنی بر فاصله به دو گروه تقسیم میشوند که عبارتند از: سلسله مراتبی[۳۳] و غیرسلسله مراتبی[۳۴].
روشهای سلسله مراتبی بیشترین کاربرد را در تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی در گونههای گیاهی دارند. این روشها با ترکیب کردن موفق یک سری یا تقسیمبندی افراد یک گروه عمل تجزیه و تحلیل را انجام میدهند. در روشهای سلسله مراتبی ترکیبی[۳۵]، ابتدا هر فرد به عنوان یک خوشه در نظر گرفته میشود. بنابراین در ابتدای کار تعداد خوشهها برابر با تعداد افراد میباشد. سپس افرادی که بیشترین شباهت را دارند، در یک خوشه قرار میگیرند. در نهایت تمام ژنوتیپها به یک خوشه واحد منتسب میگردند (محمدی و پراسانا، ۲۰۰۳).
در روش سلسله مراتب تقسیمی[۳۶]، ابتدا تمام افراد در یک گروه قرار میگیرند و سپس در درون گروه، افراد بر اساس شباهت به دو زیر گروه تقسیم میشوند و همین طور در داخل هر زیر گروه افراد بر اساس میزان کاهش شباهت تقسیمبندی میشوند تا به فرد برسد. در بین تمام روشهای سلسله مراتب ترکیبی روش گروههای غیر وزنی جفت شده[۳۷] و روش حداقل واریانس وارد [۳۸] بیشترین کاربرد را برای تجزیه خوشهای دارند (محمدی و پراسانا، ۲۰۰۳).
رینکون و همکاران (۱۹۹۶) کارایی الگوریتمهای مختلف تجزیه خوشهای مانند UPGMA و Ward را در بررسی تنوع ژنتیکی و گروهبندی مواد گیاهی بررسی نمودند و نتیجه گرفتند که UPGMA نتایج معتبری را در انطباق با روابط شجرهای مواد ژنتیکی فراهم میکند. در روش UPGMA، پس از تشکیل
هسته اولیه، هر خوشه بر اساس شباهت بین دو فرد تشکیل میشود، در مرحله بعدی شباهت یا فاصله هر فرد با افراد درون یک خوشه به صورت میانگین فاصله یا شباهت آن فرد از افراد خوشه در نظر گرفته میشود. این یک نوع روش میانگینگیری غیروزنی است. زیرا در این روش هر ژنوتیپ در خوشه دارای وزن یکسانی است. در روش وارد تشکیل گروهها بر مبنای حداقل واریانس درون گروهها و حداکثر واریانس بینگروهی انجام میگیرد. این روش با تشکیلn گروه شروع میشود و هر ژنوتیپ در ابتدا یک گروه را تشکیل میدهد و قرار گرفتن افراد در خوشهها و یا ادغام خوشهها بر این اساس است که در هر مرحله واریانس درون گروهی کمتر از واریانس بینگروهی باشد (محمدی و پراسانا، ۲۰۰۳).

تجزیه به مؤلفههای اصلی [۳۹] ۲-۵-۵-

تجزیه به مؤلفههای اصلی همراه با تجزیه خوشهای، یکی دیگر از تکنیکهای چندمتغیره است که دارای کاربرد زیادی در تجزیه تنوع ژنتیکی است. این تکنیک را میتوان برای نمایش دو بعدی پراکنش افراد به کاربرد. تجمع افراد در یک ناحیه از پلات نشاندهنده تشابه ژنتیکی آن افراد میباشد. تجزیه به مولفههای اصلی به عنوان روشی برای کاستن حجم دادهها به منظور روشن ساختن روابط بین دو یا چند متغیر و توجیه تغییرات کل دادههای اصلی و اولیه به وسیله تعداد محدودی از متغیرهای جدید مستقل به نام مؤلفههای اصلی میباشد (نجفی و همکاران، ۱۳۸۲). کاسته شدن حجم دادهها به وسیله تبدیل خطی دادههای اصلی به متغیرهای مستقل جدیدی که به عنوان مؤلفههای اصلی شناخته میشوند، انجام میگیرد. به طوری که اولین مؤلفه بیشترین مقدار تغییرات دادههای اولیه را توجیه میکند و مؤلفه دوم بیشترین مقدار تغییرات باقیمانده را بعد از مؤلفه اول توجیه میکند و الی آخر. لازم به ذکر است که هر مؤلفه تغییراتی را توجیه میکند که توسط مؤلفههای قبلی بیان نشده است. به علت اینکه مؤلفهها به صورت متعامد و مستقل از یکدیگر میباشند، هر مؤلفه نشان دهنده خصوصیات متفاوتی از دادههای اصلی میباشد و به صورت مستقل از سایر مؤلفهها باید تفسیر شود. هنگامی که از تجزیه به مولفههای اصلی برای تجزیه دادههای مولکولی استفاده میشود، احتمال ریشههای راکد منفی وجود دارد که برای بر طرف کردن این مشکل، فرانکو و همکاران (۱۹۹۷) پیشنهاد کردند که باید ماتریس تشابه یا فاصله به فرمول زیر تبدیل شود.
فرمول (۲-۶)
که در آن Sij ضریب تشابه بین افراد i ، j و Si0 میانگین ضریب تشابه فرد iام و S0j ضریب تشابه فرد jام و S0 میانگین کل ضریب تشابه میباشد.
در مورد صفات کمی در بیشتر مواقع دو یا سه مؤلفه اول بیشترین مقدار تغییرات مربوط به دادههای اولیه را توجیه میکنند (حدود ۸۰-۷۵ درصد) و این مؤلفهها برای نمایش گرافیکی جهت گروهبندی ژنوتیپها استفاده میشوند. ولی در مورد دادههای مولکولی دو یا سه مؤلفه اول حداکثر حدود ۲۰-۱۰ درصد تغییرات اولیه نشانگرها را توجیه میکنند. هر چند که این نتایج ممکن است از نقطه نظر آماری برای PCA و نمایش گرافیکی مناسب نباشد، ولی از نقطه نظر ژنتیکی نشاندهنده نمونهبرداری مطلوب نشانگرها از کل ژنوم میباشد. به این ترتیب که هر یک از نشانگرهای مورد استفاده از بخشهای متفاوت ژنوم هستند، بنابراین دارای همبستگی کمتر هستند. انتخاب تعداد مؤلفهها در این حالت میتواند بر اساس ریشههای راکد مؤلفهها باشد. مؤلفههایی با ریشه راکد بزرگتر از یک میتوانند به عنوان مؤلفههای مؤثر در گروهبندی استفاده شوند (تامسون، ۱۹۹۸).

۲-۶- معیارهای محتوای اطلاعات نشانگرها و معیارهای اندازهگیری تنوع ژنتیکی

۲-۶-۱- محتوای اطلاعاتی چندشکل[۴۰]

محتوای اطلاعاتی چندشکل به عنوان یک آماره برای نشان دادن میزان چندشکلی یک نشانگر، میتواند از صفر تا یک متغیر باشد. هر اندازه این عدد بزرگتر باشد، بیانگر وجود تعداد آللهای زیاد و فراوانی بالای چندشکلی برای جایگاه در جمعیت تحت مطالعه است. همچنین PIC بالا نشان دهنده این است که برخی از نشانگرها برای تمایز بین ژنوتیپهای با خویشاوندی نزدیک بسیار مفیدند (بوتستین و همکاران، ۱۹۸۰). این پارامتر از طریق فرمول زیر محاسبه میشود:
 
فرمول (۲-۷)
در این فرمول pفراوانی آلل i ام برای نشانگرهای همبارز است.

۲-۶-۲- معیارهای اندازهگیری تنوع ژنتیکی

برای بررسی میزان تنوع ژنتیکی در یک جمعیت به معیارها و روشهایی نیاز داریم که اطلاعات مربوط به ژنتیک آن جمعیت را اندازهگیری کنند. تنوع ژنتیکی را میتوان در قالبهای مختلفی مورد بررسی قرار داد. این قالبها میتوانند شامل اندازهگیریهای تعداد آللها، فراوانی نسبی آللها و تفاوت آللهای مورد بررسی باشد. میزان هتروزیگوسیتی بهترین و عمدهترین روش برای اندازهگیری تنوع است. با این حال روشهای متعدد دیگری هم وجود دارند که میتوانند بیانگر مقدار تنوع ژنتیکی در یک جایگاه ژنی یا تعدادی از جایگاههای ژنی مشابه باشد. در مواردی که حفظ بقای جمعیتهای در معرض انقراض مطرح است، تمرکز مباحث ژنتیکی بیشتر درباره حفظ تنوع ژنتیکی در این جمعیتهاست. در این مورد فرض بر این است که هر قدر هتروزیگوسیتی در این جمعیتها بالا باشد، احتمال بقای این جمعیتها بیشتر است. میزان هتروزیگوسیتی یکی از مهمترین معیارهای اندازهگیری تنوع ژنتیکی درون جمعیتی است (هدریک، ۱۹۹۸).

هتروزیگوسیتی یا تنوع ژنی [۴۱] ۲-۶-۳-

متداولترین روش اندازهگیری تنوع ژنتیکی در یک جمعیت، سنجش میزان هتروزیگوسیتی آن جمعیت است. زیرا موجودات در یک جایگاه ژنی خاص هتروزیگوت و یا هموزیگوت هستند. با توجه به این که هتروزیگوتها آللهای متفاوتی دارند، فراوانی آنها مهم بوده و نشان دهنده وجود تنوع است.
میزان هتروزیگوسیتی معمولترین معیار تنوع ژنتیکی در یک جمعیت میباشد که به دو شکل هتروزیگوسیتی مشاهده شده[۴۲] و هتروزیگوسیتی مورد انتظار[۴۳] گزارش میشود.
وییر (۱۹۹۶) استفاده از تنوع ژنی را به جای هتروزیگوسیتی مورد انتظار مناسبتر دانست. هر دو معیار برای یک جایگاه یا به صورت میانگین چند جایگاه گزارش میشوند.
هتروزیگوسیتی مشاهده شده برای یک جایگاه با فرمول (۲-۸) محاسبه میشود:
فرمول (۲-۸)
در این رابطه Nij (i≠j) تعداد افراد هتروزیگوت و N تعداد کل افراد در جمعیت مورد مطالعه میباشد. هتروزیگوسیتی مورد انتظار برای یک جایگاه از فرمول (۲-۹) محاسبه میگردد (هدریک، ۱۹۹۸).
فرمول (۲-۹)
در این رابطه عبارت  نسبت مورد انتظار هموزیگوتها است و Pi فراوانی i امین آلل در یک جایگاه معین هستند. نی در سال ۱۹۷۸ این فرمول را معیار اندازهگیری تنوع ژنی نامید و بیان کرد که این فرمول برای جانداران دیپلوئید و برای جانداران با سیستم تولیدمثلی خاص و متفاوت از پستانداران میتواند معرف میزان هتروزیگوسیتی باشد.
فصل سوم:
مواد و روش ها
۳-۱- مواد و روشها
در این بررسی ابتدا ژنوتیپهای مختلف برنج برای تحمل به شوری در مرحله گیاهچه ارزیابی شدند و سپس با استفاده از نشانگرهای ریزماهواره تنوع ژنتیکی ارقام تعیین گردید.

۳-۱-۱- بررسی تحمل به شوری ژنوتیپها در مرحله گیاهچه

در این بررسی ۲۹ ژنوتیپ برنج شامل لاینهای خالص وارداتی و ارقام بومی و اصلاح شده از موسسه بین المللی تحقیقات برنج[۴۴] و همچنین موسسه تحقیقات برنج کشور ارزیابی شدند (جدول ۳-۱). آزمایش به صورت کرتهای خرد شده و در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی با دو سطح فاکتور اصلی (شوری ۸ دسیزیمنس برمتر و شاهد) و ۲۹ سطح فاکتور فرعی (ژنوتیپها) در سه تکرار انجام شد. این مرحله از آزمایش به روش گریگوریو و سندهیرا (۱۹۹۳) در گلخانه و در سال ۱۳۸۷ انجام شد. برای کشت از صفحات یونیلیت و سینیهای کشت استفاده گردید (شکلهای ۳-۱ و ۳-۲) بذور به مدت ۱۰ دقیقه با محلول ۵ درصد هیپوکلریت سدیم ضدعفونی شدند و پس از شستشو با آب مقطر استریل به ظروف پتری حاوی کاغذ صافی منتقل گردیدند. مقدار کمی آب مقطر استریل به ظروف اضافه شد تا کاغذ صافی و بذور کاملا مرطوب و خیس شوند. بذور جوانه زده در روز سوم به داخل هر سوراخ و روی شبکههای نایلونی (صفحههایی از جنس پلاستیک با سوراخهای ریز که ریشهچهها از آن عبور داده شدهاند) انتقال داده شدند. در هر سوراخ (واحد آزمایشی) ۳ بذر جوانه زده نشاء گردید. تا سه روز پس از انتقال از آب مقطر استفاده شد. سپس محلول غذایی یوشیدا طبق جدول (۳-۲) به سینیها اضافه شد. محلول غذایی هر ۷ روز تعویض شد.pH محلول هفتهای ۳ بار کنترل گردید و با اضافه نمودن HCl و NaOH،pH محلول روی ۵/۵ ثابت نگه داشته شد. گیاهچههای برنج در شرایط محیط شاهد به مدت ۳۵ روز در محلول غذایی یوشیدا قرار گرفتند و در شرایط محیط شور گیاهچههای برنج تا ۱۴ روز در محلول غذایی یوشیدا و سپس به مدت ۲۱ روز در محیط شور رشد نمودند. سپس از هر محیط به طور جداگانه و در مرحله ۲ تا ۳ برگی نمونهبرداری صورت گرفت. در مرحله سه برگی امتیازدهی طبق روش گریگوریو و همکاران (۱۹۹۷) و جدول (۳-۳) انجام گردید. طول ریشه و اندام هوایی، وزن خشک ریشه و اندام هوایی، زیستتوده، محتوای کلروفیل، سطح برگ و نسبت سدیم به پتاسیم در اندام هوایی اندازهگیری شد.
جدول ۳-۱- منشا ژنوتیپهای مورد بررسی در مرحله گیاهچه

منشا ژنوتیپ شماره
دانلود کامل پایان نامه در سایت pifo.ir موجود است.