مطالعه تنوع ژنتیکی ۲۹ ژنوتیپ مختلف برنج بر اساس صفات گیاهچه ای و …

۵- سپس تیوبها از حمام آب گرم خارج گردیدند و مقدار ۹۲ میکرولیتر کلرید سدیم ۵ مولار به آنها اضافه شد و به آرامی تکان داده شدند.
۶- در این مرحله ۷۲ میکرولیتر از CTAB به مخلوط اضافه شد و تیوبها به مدت ۱۰ دقیقه در حمام آب گرم ۶۵ درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
۷- ۷۲۳ میکرولیتر کلروفورم (کلروفورم + ایزوآمیل الکل ۲۴:۱) در زیر هود به مخلوط اضافه شد و با دست به آرامی تکان داده شد.
۸- در این مرحله تیوبها به سرعت به مدت ۵ دقیقه با سرعت ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه (g 15680) در دمای ۲۸ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند.
۹- مایعرویی (سوپرناتانت)[۵۰] به دقت از بخش زیرین جدا شد و به تیوبهای ۵/۱ میلیلیتری دیگری منتقل گردید.
۱۰- ۶۰۰ میکرولیتر ایزوپروپانول سرد (۴ درجه سانتیگراد) به تیوبها اضافه گردید و به آرامی تکان داده شدند. با گذشت چند لحظه کلافهای DNA در محلول ظاهر شدند. سپس تیوبها به مدت ۴ دقیقه با سرعت ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه (g 15680 (در دمای ۴ درجه سانتیگراد برای رسوب کلاف DNA سانتریفیوژ شدند.
۱۱- محلول باقیمانده به آرامی دور ریخته شد وDNA رسوب کرده در پایین تیوب با اتانول ۷۰ درصد شسته شد. عمل شستشو ۲ تا ۳ بار تکرار گردید، سپس تیوپها در دمای محیط قرار گرفتند تاDNA موجود خشک گردد.
۱۲- رسوب یا کلاف DNA در۱۰۰ میکرولیتر محلول TE سرد (۱۰ میلیمول Tris-HCl با ۸pH = ، ۱ میلیمول EDTA با ۸pH =) حل گردید.
۱۳- تیوبها در حمام آب گرم و دمای ۷۵ درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ تا۳۰ دقیقه قرار گرفتند.
۱۴- مخلوط فوق به مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۸۰۰۰ دور در دقیقه (g 8/10572) سانتریفیوژ گردید و فاز بالایی به تیوبهای ۵/۱ میلیلیتری انتقال داده شد.
کلیه وسایل مورد استفاده در فرآیند استخراج DNA قبلا در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۲۰ تا۳۰ دقیقه اتوکلاو شدند و تنها یکبار مورد استفاده قرار گرفتند. محلول DNA حاصل در فریزر ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شد.

۳-۳-۲- تعیین غلظت و کمیت DNA

برای تعیین غلظت و کیفیت DNA استخراج شده از اسپکتروفتومتری و همچنین الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد. از DNA فاژ لامبدا که غلظت آن مشخص بود، برای تعیین غلظت نمونههای DNA استفاده گردید. از نحوه تشکیل نوارها میتوان به کیفیت DNA استخراج شده پیبرد، زیرا DNA سالم و با وزن مولکولی زیاد به صورت یک نوار واضح و نمونههای خرد شده به صورت یک نوار کشیده شده[۵۱] در طول ژل مشاهده خواهند شد. اگر در فاصله بین نوار و چاهک کشیدگی دیده شود، بیانگر آلودگی توسط پروتئینها و چنانچه یک نوار اضافی به همراه یک هاله کم رنگ در زیر ژل و با فاصله از نوار دیده شود، حاکی از وجود RNA در نمونهها است. نمونههایی که کیفیت DNA آنها پایین بود، مجددا استخراج شدند. تعیین غلظت و کیفیت DNA به صورت زیر انجام شد:
معمولا برای تعیین کمیت و کیفیت DNA از ‍ژل آگارز ۷/۰ تا ۱ درصد، و برای محصولات PCR از ژل ۵/۲ درصد استفاده شد. بسته به هدف (تعیین کمیت DNA و یا محصولات PCR) مقدار آگارز مورد نظر وزن گردید و در ۱۰۰ میلیلیتر بافر TBE(1X)، ریخته شد. برای بارگذاری نمونهها از نسبتهای DNA (4 میکرولیتر) و محلول رنگی بارگذاری[۵۲] (۲ میکرولیتر) استفاده گردید. همچنین برای مشاهده و عکسبرداری ژل از دستگاه ژل داک (Bio-RAD، ۲۰۰۰) استفاده گردید. پس از مقایسه نمونههای DNA با شاهد (DNA لامبدا)، غلظت هر یک از آنها مشخص شده و به عنوان محلول اصلی DNA ژنومی در فریزر ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

۳-۳-۳- واکنش زنجیرهای پلیمرازPCR

مواد مصرفی حجم مورد نیاز (x1)
محلول مادری[۵۳]
آغازگر مستقیم[۵۴]
آغازگر معکوس[۵۵]
DNA
H2O
۱۰
۲
۲
۴
۲

واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر Bio-RAD حاوی ۹۶ چاهک در حجم ۲۰ میکرولیتر انجام گردید که هر واکنش حاوی مواد زیر میباشد (جدول ۳-۴).
جدول ۳-۴- مواد مورد استفاده در واکنش زنجیرهای پلیمراز

۳-۳-۴- شرایط بهینه و انجام واکنش PCR

برای انجام واکنش PCR تیوبها در دستگاه PCR (Bio-RAD) icycler در معرض دورههای حرارتی بهینه شده قرار گرفتند و دستگاه برای ۳۶ دور انجام واکنش، برنامهریزی شد. برنامههای حرارتی و دورههای زمانی بهینه شده در جدول (۳-۵) ارائه شده است. پس از اتمام واکنش، نمونهها از دستگاه خارج و تا هنگام الکتروفورز در فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. چرخههای حرارتی برای PCR به صورت تاچ داون برنامهریزی شد. بدین ترتیب که دمای اتصال آغازگر به رشته الگو ۱۰ درجه سانتیگراد بالاتر از دمای اتصال واقعی در نظر گرفته شد و در هر چرخه، یک درجه از دمای اتصال کاسته شد، تا اینکه دمای اتصال آغازگر حاصل گردید. این کار از ایجاد نوارهای اضافی که در چرخههای حرارتی عادی ایجاد میشوند، جلوگیری میکند (دان و همکاران، ۱۹۹۱).

۳-۳-۵- آغازگرهای مورد مطالعه

کلیه آغازگرهای ریزماهواره مورد استفاده (۳۰ جفت) توسط شرکت MWG Biotech کشور آلمان ساخته شد. فهرست کامل این آغازگرها در (جدول ۹ پیوست) ارائه شده است. این آغازگرها با استفاده از نقشههای ریزماهواره ارائه شده توسط (چن و همکاران، ۱۹۹۷؛ تمنیخ و همکاران، ۲۰۰۰؛ مک کوچ و همکاران، ۲۰۰۲) طوری انتخاب شدند که توزیع یکنواختی بر روی ۱۲ کروموزوم برنج داشته باشند.
جدول ۳-۵ چرخه حرارتی و زمان بهینه شده در مراحل مختلف واکنش زنجیرهای پلیمراز
(برای دمای اتصال[۵۶] ۵۵ درجه سانتیگراد)

برای دانلود متن کامل این فایل به سایت torsa.ir مراجعه نمایید.