مطالعه تنوع ژنتیکی ۲۹ ژنوتیپ مختلف برنج بر اساس صفات گیاهچه ای …

نسبتا مقاوم

رشد عقب افتاده، بسیاری از برگها لوله شده، تعدادی از برگها بلندند

۵

حساس

رشد متوقف، بسیاری از برگها خشک و تعدادی از گیاهان مرده‌اند

۷

بسیار حساس

همه گیاهان مرده و خشک‌اند

۹

۳-۲- صفات مورد ارزیابی

محتوای کلروفیل برگها با کلروفیلمتر (SPAD-502) اندازهگیری شد. برای محتوای کلروفیل برگها با کلروفیلمتر، دومین برگ از نوک ساقه انتخاب شد و در ۴ موقعیت میزان کلروفیل برگها به روش شابالا و همکاران (۱۹۹۸) اندازهگیری شد.
برگهایی که میزان کلروفیل آنها اندازهگیری شده بود جمعآوری شد و سطح برگ آنها با دستگاه سطح برگسنج (MK2, DELTA-T DEVICES, Burwell, England) اندازهگیری شد. سپس نمونهها در آون با دمای ۷۰ درجه سانتیگراد به مدت ۷۲ ساعت خشک شدند پس از آن نمونهها با ازت مایع پودر شدند و میزان سدیم و پتاسیم آنها با دستگاه فلیم فتومتر Jenway – PFP7)) ارزیابی گردید.
برای تعیین میزان سدیم و پتاسیم ابتدا یک گرم برگ گیاه برنج پودر شده توسط ازت مایع داخل بوته چینی ریخته شد و به مدت ۴ ساعت در کوره ۵۵۰ درجه سانتیگراد قرار داده شد. پس از این مدت خاکستر بوتهها در هوای آزاد قرار گرفتند تا خنک شوند. سپس مقداری آب مقطر داخل همان بوتههای چینی به پودر گیاه اضافه گردید و مقدار ۵ میلیلیتر اسید کلریدریک ۲ نرمال نیز اضافه شد (برای تهیه اسید کلریدریک ۲ نرمال مقدار ۱۶/۶ میلیلیتر اسید کلریدریک غلیظ با آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلیلیتر رسانده شد). بوتههای چینی در حمام بنماری در تماس با بخار آب ۹۰ درجه سانتیگراد به مدت نیمساعت قرار داده شدند و پس از گذشت این زمان محتویات بوتهها به بالون ژوژه ۵۰ میلیلیتری منتقل گردید و با آب مقطر به حجم رسانده شد و سپس در بالون دیگری با کمک کاغذ صافی واتمن شماره ۴۲ صاف شد. عصاره بافت گیاهی آماده شده تا حدود ۶ ماه قابل استفاده میباشد. برای قرائت میزان سدیم و پتاسیم عصاره بافت گیاهی در ابتدا محلولهای استاندارد کلرید سدیم و کلرید پتاسیم ساخته شد و میزان سدیم و پتاسیم بافت گیاهی با دستگاه فلیم فتومتر قرائت شد.
با توجه به این که در این پژوهش ژنوتیپها در دو محیط بدون تنش و تنش شوری بررسی شدند، شدت تنش ((SI[45] برای هر یک از دو سطح شور و شاهد طبق فرمول زیر محاسبه شد:
 
در این فرمول  و  به ترتیب میانگین صفت مورد نظر در تمام ژنوتیپها در شرایط شور و شاهد است.
شاخصهای زیر برای ارزیابی واکنش آنها نسبت به تنش شوری محاسبه گردیدند:
۱- شاخص تحمل (TOL)[46] روزیل و هامبلین (۱۹۸۱)
TOL = YP-YS
در این رابطه YP و YS به ترتیب برای میانگین ارقام در شرایط شاهد و شور در مرحله گیاهچه میباشند.
۲- شاخص حساسیت به تنش (SSI)[47] فیشر و مورر (۱۹۷۸)
YP و YS به ترتیب برای میانگین ارقام در شرایط شاهد و شور در مرحله گیاهچه میباشند.
 
۳- شاخص تحمل به تنش (STI)[48] فرناندز (۱۹۸۰)
میانگین صفت مورد نظر در تمام ژنوتیپها در شرایط شور و شاهد است.

۳-۳- مراحل استخراج DNA

۳-۳-۱- نمونهبرداری

در مرحله گیاهچه، نمونههای برگی در اوایل صبح از ارقام مختلف گیاهان به طور جداگانه جمعآوری گردید و برگهای هر نمونه درون فویل همراه با اسم رقم بستهبندی و بلافاصله درون ظرف یخ نگهداری شد و سپس به آزمایشگاه منتقل و در فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. در مرحله بعد DNA ژنومی نمونهها استخراج شد و در نهایت کیفیت و کمیت DNA استخراج شده تعیین شد.
استخراج DNA به روش CTAB[49] (سقای معروف و همکاران، ۱۹۹۴) به صورت زیر انجام شد:
۱- ابتدا برگها به کمک نیتروژن مایع در هاون چینی به خوبی پودر شدند. سپس ۷۰ تا ۸۰ میلیگرم از پودر حاصل در داخل تیوبهای ۲ میلیلیتری ریخته شد و تیوبها در داخل ظرف محتوی یخ قرار گرفتند. برگهای باقیمانده برای استفاده بعدی در فریزر ۸۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
۲- ۵۳۴ میکرولیتر محلول استخراج (۱۰۰ میلیمول Tris-HCl با ۸pH = ، ۵۰ میلیمول EDTAبا ۸= pH، ۵۰۰ میلیمول کلرید سدیم، ۵/۲ % وزن به حجم SDS) که قبلا دمای آن به ۶۰ درجه سانتیگراد رسیده بود به تیوبها اضافه شد، سپس درب تیوبها بسته شد و به آرامی تکان داده شد تیوبها در سطح یخ نگهداری شدند.
۳- مقدار ۲۸ میکرولیتر از (SDS 20 درصد) به مخلوط اضافه و با دور پایین ۴ دقیقه تکان داده شد.
۴- تیوبها به مدت ۱۵ دقیقه در حمام آب گرم ۶۵ درجه سانتیگراد قرار گرفتند. در طول این مدت به فاصله هر ۳ تا ۴ دقیقه تیوبها، از حمام آب گرم خارج شده و به آرامی تکان داده شدند تا پودر برگی همیشه در حالت تعلیق باقی بماند و محلول استخراج بتواند تمام مواد را به طور یکسان تحت تاثیر قرار دهد.

برای دانلود فایل متن کامل پایان نامه به سایت 40y.ir مراجعه نمایید.