بررسی تاثیر سطوح تغذیه ای اسانس سنبل کوهی و مرزن جوش بر بیان ژن …

۲-۳-۱-۳- انواع اندازه گیریها در تکنیک Real-Time PCR
۲-۳-۱-۳-۱-اندازهگیری مطلق
در تکنیک اندازه گیری مطلق[۶۹]، هدف تعیین مقدار دقیق اسید نوکلئیک است. بدین منظور، از توالی ‏اسید نوکلئیکیای که قرار است مورد سنجش واقع شود، رقتهای پشت سر هم تهیه میشود ‏توسط آنها منحنی خطیای به نام منحنی استاندارد رسم میگردد. این منحنی یک ارتباط خطی ‏بین سیکل آستانه (Ct‏) و مقدار اولیه RNA ‏و یا cDNA[70] ‏ایجاد مینماید. در نتیجه براساس ‏مقادیر (Ct) ‏نمونههای مجهول و مقایسه آنها با منحنی استاندارد، غلظت آنها تعیین میشود. استاندارد ‏ساخته شده، میتواند از جنس DNA ‏دو رشتهای، DNA ‏تک رشتهای و یا RNA ‏باشد. اما ‏دیده شده است که استانداردهای DNA‏ای، دارای محدوده قابل تشخیص گستردهتر، حساسیت، تکرارپذیری و پایداری بیشتری نسبت به استانداردهای RNA‏ای میباشد. برای ساخت استانداردDNA ‏ای میتوان از روش کلون کردن ژن هدف داخل پلاسمید یا از خالصسازی محصولPCR ‏ و یا سنتز مستقیم اسید نوکلئیک مورد نظر استفاده کرد. کمیت یابی مطلق نیاز به طی مراحل بیشتری داشته و در آن اندازه نسخه واقعی نوکلئیک اسید در نمونه سنجیده میشود(هوگت، ۲۰۰۵؛ جنتل، ۲۰۰۱).
۲-۳-۱-۳-۲-اندازهگیری مطلق
در اندازه گیری نسبی[۷۱]، تغییرات در سطوحmRNA یک ژن نسبت به یک استاندارد خارجی یا یک نمونه مرجع (ژنهای خانهدار)[۷۲] که به عنوان کالیبراتور در نظر گرفته میشود، اندازه گرفته میشود. در اندازهگیری کمی، نیاز به منحنی استاندارد با غلظتهای معین نیست و نمونه مرجع میتواند هر رونوشتی که توالی آن شناخته شده است، باشد (تری کاریکو و همکاران،۲۰۰۲).
در تکنیک اندازه گیری کمی ‏از یک ژن مرجع برای نرمال کردن مقادیر به دست آمده از اسید نوکلئیک مورد سنجش استفاده میشود. نرمال کردن باعث تصحیح تنوع موجود بین نمونهها میشود. بدین ترتیب که مقدار به دست آمده از اسید نوکلئیک هدف را بر مقدار به دست آمده از ژن مرجع تقسیم میکنیم که به این کار نرمال کردن میگویند (هید وهمکاران، ۱۹۹۶). از ویژگیهای بارز ژن مرجع آن است که در شرایط مختلف از قبیل بیماریها و بافتهای متفاوت، تیمارهای متفاوت، بیان نسبتاً ثابتی داشته باشد. لذا نرمال کردن مقدار اسید نوکلئیک توسط این قبیل از ژنها، میتواند تفاوتهای موجود بین نمونههای را تا حد زیادی بر طرف نماید. تاکنون مدلهای ریاضی گوناگونی برای محاسبه بیان یک ژن هدف نسبت به ژن مرجع مناسب در نظرگرفته شده است (دوراک، ۲۰۰۶; یان و همکاران، ۲۰۰۶) که در ذیل آورده شده است.
(۲-۱) R = 2[Csampl – CPcontrol]
(۲-۲) R = 2– [rCsampl – rCPcontrol]
(۲-۳)
(۲-۴)
در این ۴ ‏فرمول نسبت بیان ژن هدف به ژن مرجع سنجیده شده است. در دو فرمول اول این نسبت، بدون در نظر گرفتن تفاوت در کیفیت تکثیر در دو ژن، به دست میآید. در حالیکه در دو فرمول دیگر این اختلاف با نرمالیزه کردن اصلاح میشود (پافافل، ۲۰۰۱، ۲۰۰۴).
۲-۳-۱-۴-راندمان واکنش
راندمان تکثیر یک واکنش[۷۳] در تعیین کمیت نسبی معیاری با اهمیت میباشد. در گذشته راندمان تکثیر واکنش ایدهآل را یک در نظر میگرفتند که این به معنی دو برابر شدن غلظت محصول PCR طی هر چرخه در فاز نمایی واکنش میباشد (گیبسون و همکاران، ۱۹۹۶). اما امروزه میدانیم که بیشتر PCRها بازده صد درصدی را ندارند و اگر ما از فاکتوری جهت تصحیح استفاده نکنیم تخمینی بالاتر از غلظت واقعی بدست میآوریم (لیو، ۲۰۰۲). راندمان تکثیر در یک واکنش با استفاده از منحنی استاندارد به کمک فرمول زیر محاسبه میگردد( دوراک، ۲۰۰۶).
= [۱۰(-۱/Slope)]-1 Efficiency of the Reaction
شیب ایده آل باید ۳/۳- باشد که بازدهی برابر با ۱۰۰ درصد شود که در این حالت دو برابر افزایش محصول در طی هر چرخه داریم. بازدهی تکثیر واکنش در اوایل فاز نمایی ثابت است اما به تدریج تا صفر کاهش مییابد علت کاهش را میتوان به کاهش کارایی فعالیت پلیمرازی و کم شدن اجزای واکنش PCR دانست (لیو، ۲۰۰۲). شیب محاسبه شده مربوط به خط حاصل از پلات نمودن مقادیر سیکل آستانه در مقابل لگاریتم رقتهای ۱۰ برابر اسید نوکلئیک هدف است (دوراک، ۲۰۰۶).
شکل ۲-۸: توصیف منحنی استاندارد با بازدهی ایدهآل، (دایرههای توپر) و بازدهی پایین، (دایرههای توخالی)
۲-۳-۱-۵-انتخاب ژن مرجع
همان طور که گفته شد ازمزایای Real-Time PCR ‏استفاده از کالیبراتور داخلی است. کالیبراتور داخلی ژنی است که بدون ارتباط به بیماری، در سلولهای تحت بررسی به طور پیوستهای بیان میشود. موارد قابل توجه در انتخاب ژن مرجع عبارتند از:
۱_ عدم تاثیر پذیری سطح نسخههای ژن کنترل در اثر بیماری
۲_ یکسان بودن تخریب ژن مرجع با ژن هدف
با استفاده از ژن مرجع میتوان علی رغم وجود تغییرات در کیفیت RNA ‏و کارایی هر واکنش، ارزیابی دقیق انجام داد. به این منظور از مفهوم نرمال کردن استفاده میکنیم(اورلندو و همکاران ، ۲۰۰۲).از آنجایی که ژنهای مرجع شناخته شدهای مانند GAPDH β-actin توسط تیمارهای مختلف و فرایندهای زیستی و انواع مختلف بافتها تحت تاثیر قرار میگیرند، در نتیجه نرمالیزه نمودن تنها با یک ژن مرجع میتواند باعث انحرافاتی در نتایج شود. لذا لازم است از اثبات بیان ژن مرجع در نمونههای مورد آزمایش اطمینان حاصل گردد (ونگ وهمکاران، ۲۰۰۵).
۲-۳-۱-۶-مزایای تکنیکReal-Time PCR
شمارش کمی سریع، اندازهگیری سیکل به سیکل، بدون نیاز به مراحل Post-PCR ‏دقت، تکرار ‏پذیری بالا، حساسیت و اختصاصیت بالا، کاهش آلودگی، استفاده از کالیبراتور داخلی (عدم تداخل تخریب RNA ‏و کارایی واکنش)، در این تکنیک تفاوت در بیان ژنها بین نمونهها در حد ۲۳ درصد را میتوان شناسایی کرد، همچنین میتوان بین mRNAهایی که توالی نزدیکی به هم دارند تفاوت قائل شد. تکنیک Real-Time PCR ‏امروزه کاربردهای زیادی در اکثر حیطههای علوم زیستی یافته است (دوراک، ۲۰۰۶; مالینن و همکاران، ۲۰۰۳).
۲-۴-مروری بر تحقیقات انجام شده:
سینگ و همکاران در سال ۲۰۱۲ جهت بررسی بیان ژنهای سایتوکاین و تولید اسید نیتریک در جوجه های گوشتی واکسینه شده با واکسن سالمونلا تیفی موریوم آزمایشی انجام دادند. نتاج نشان داد که جوجه های واکسینه شده در مقایسه با گروه شاهد همزمان با افزایش تولید اسید نیتریک، میزان بیان ژن IFNγ افزایش یافته اما میزان بیان ژن IL-2 کاهش یافته است.
سین و همکاران در سال ۲۰۰۹ جهت بررسی بیان ژن های سایتوکاین در جوجه های گوشتی و اردک های آلوده به ویروس آنفلوآنزای مرغی، مطالعه ای انجام دادند و گزارش کردند که بیان ژن IFNγ در کبد جوجه های گوشتی بیش از اردک است و در حالی که بیان ژن IFNα در هردو گونه یکسان است.
حقیقی و همکاران در سال ۲۰۰۸ به منظور بررسی بیان ژن های سایتوکاین در جوجه های گوشتی تیمار شده با پروبیوتیک گزارش کردند که با توجه به اینکه پروبیوتیک ها برای کنترل پاتوژن ها و افزایش پاسخ ایمنی در جوجه های گوشتی بکار برده می شوند بیان ژن های IL-12 (اینترلوکین ۱۲) وINFg (اینترفرون گاما) در پرندگان آلوده به سالمونلا تیفی موریوم تیمار شده با پروبیوتیک نسبت به پرندگانی که تیمار نشده کاهش می یابد.
جنت و همکاران در سال ۲۰۰۸ اثرات استفاده از سطوح تغذیه ای مکمل کرومیوم بر بیان ژن IFNγ در جوجه های گوشتی واکسینه شده با واکسن ویروس بیماری نیوکاسل را بررسی کردند. در این آزمایش از ۷ گروه تیمار استفاده کردند که گروه اول به عنوان شاهد بود و ۳ گروه تیمار به خوراک اضافه شده بود. در سطوح F500, F1000,F1500 و ۳ گروه تیمار دیگر هم به آب آشامیدنی طیور به صورتW250, W500, W750 اضافه شد و طیور در کل دوره پرورش از کروم استفاده کردند و در روز ۴۹ سه پرنده از هر تکرار به طور تصادفی انتخاب و واکسن ویروس نیوکاسل تزریق شد و سپس ۷ روز پس از تزریق از بافت کبد نمونه برداری شده و آزمایش Real Time PCR انجام شد . نتایج نشان داد که استفاده از مکمل کروم در جیره طیورگوشتی بیان ژن IFNγ را افزایش می دهد.
کوقوت و همکاران در سال ۲۰۰۵ بیان mRNA ژن IFNg در جوجه های مبتلا به عفونت سالمونلا با استفاده از روش Real Time PCR بررسی کردند و نتایج نشان داد که با توجه به اینکه ژن های سایتوکاین دارای نقش مهمی در سیستم ایمنی ذاتی طیور دارند اما بیان ژن IFNg تغییری نکرد.
سیجبین و همکاران در سال ۲۰۰۳ اثرات استفاده اسیدهای چرب غیر اشباع بر بیان ژن های سایتوکاین در جوجه های گوشتی واکسینه شده با سالمونلا تیفی موریوم را بررسی کردند و در این آزمایش در جیره غذایی طیور از روغن های ذرت ، کتان، سورگوم و چربی (پیه) گاو استفاده کردند و طیور دو ساعت پس از تزریق سالمونلا تیفی موریوم پلی ساکارید کشته شدند و از بافت کبد استخراج RNA انجام شد و نتایج حاصل از Real Time PCR نشان داد که بیان ژن های IL-6 ، IL-8 وIFNg در جوجه های تیمار شده با اسیدهای چرب غیر اشباع افزایش یافت.
موسوی و همکاران (۱۳۸۷) ، اثرات اسانس آویشن شیرازی و نایسین را بر روی رشد سالمونلا تیفی موریوم مورد بررسی قرار دادند .در این مطالعه اثر غلظت های مختلف توام اسانس آویشن شیرازی و نایسین در درجه حرارت (۸ و۲۵درجه سانتیگراد) و زمان نگهداری (تا۲۱روز) بر روی رشد سالمونلا تیفی موریوم مورد بررسی قرار گرفت. رشد سالمونلا تیفی موریوم در ۸ درجه سانتیگراد بطور معنی دار تحت تاثیرغلظتهای توام اسانس و نایسین قرار گرفت. عمل ممانعت کنندگی مواد مذکور در ۸ درجه سانتیگراد در غلظت های بالاتر از ۰۰۵/۰ در صد اسانس قوی بود به طوریکه تعداد باکتری در روز دوم مطالعه در غلظتهای توام ۰۱۵/۰ اسانس و ۵/۰ نایسین، ۰۳/۰ اسانس و ۲۵ /۰ نایسین، ۰۳/۰ اسانس و ۵/۰ نایسین به کمتر از لگاریتم ۲ رسید . غلظت های مختلف توام اسانس که در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفت در ۲۵ درجه سانتیگراد روی رشد باکتری مورد بررسی تاثیری نداشت و تعداد باکتری در روز اول مطالعه به بیشتر از لگاریتم ۶ رسید.
کمالی سنگانی و همکارانش در سال ۱۳۹۱ ، تاثیر گیاه دارویی زرد چوبه بر بیان ژن ۲MUC را در جوجه های گوشتی مورد بررسی قرار دادند. یافته های حاصل کاهش معنی داری در بیان ژن ۲MUC در جوجه های تغذیه شده با جیره پایه و بدون مکمل گیاه داروئی نشان داد. با توجه به نقش گیاه داروئی در افزایش فعالیت برخی از آنزیم های مرتبط با موسین و یا با تاثیر مستقیم بر تولید موسین، این گیاه می تواند جهت بهبود ژنتیکی عملکرد دستگاه گوارش طیور بکار رود.
فصل سوم: فرآیند پژوهش
۳-۱-محل انجام آزمایش
این تحقیق از اوایل اردیبهشت ۱۳۹۲ تا پایان مهر۱۳۹۲ در موسسه تحقیقات علوم دامی کرج واقع در استان البرز انجام شد. بطور کلی تحقیق شامل دو بخش اصلی: پرورش که در فارم موسسه و بخش آزمایشگاهی که در آزمایشگاه بیوتکنولوژی موسسه صورت پذیرفت به اجرا در آمد.
۳-۲-جامعه مورد مطالعه
به منظور این آزمایش تعداد ۱۲۶ جوجه خروس گوشتی نژاد آرین تهیه گردید که در قالب ۷ تیمار و ۶ تکرار و در هر تکرار ۳ قطعه جوجه پرورش داده شد. شرایط دما ، نور، و ترکیب جیره برای تمامی طیور یکسان بود.
۳-۲-عملیات مدیریتی در اجرای طرح:
۳-۲-۱-آماده سازی سالن:
۱- حمل و خارج نمودن آبخوریها و دانخوریها از سالن به بیرون جهت شستشو و ضدعفونی.
۲- گردگیری از روی هواکشها، توری، باکسها و دیوارها.
۳- شستن سالن با آب.
۴- ضدعفونی کامل سالن با محلولهای ضد عفونی کننده.
۵- شعله گرفتن کف سالن و دیوارها تا ارتفاع یک متری.
۶- پخش تراشه چوب در داخل باکسها به عنوان بستر به مقدار چهار کیلوگرم برای هر متر مربع.
یک روز قبل از ورود جوجهها به سالن پرورش دستگاه تامین کننده گرما(هیتر) روشن گردید تا دمای سالن به حد مناسب برسد. ظروف آبخوری و دانخوری نیز قبل از ورود جوجهها در سالن نصب شدند.

دانلود متن کامل پایان نامه در سایت jemo.ir موجود است