بررسی تاثیر سطوح تغذیه ای اسانس سنبل کوهی و مرزن جوش بر بیان ژن موسین در …

اسمیرنو و همکاران (۲۰۰۶)، طی بررسیهای خود مشاهده نمودند افزایش ترشح موسین همراه با افزایش میزان بیان mRNA ژن موسین نیز می باشد. این محققین نشان دادند که تغذیه جنین با گلوکز سبب افزایش بیان ژن موسین (۲MUC) می شود. اگرچه مکانیسم هایی که در اثر آنها ترکیب جیره روی دینامیک موسین تاثیرگذار می باشد به خوبی شناسایی نشده است ولی بررسی های به عمل آمده نشان داد که حضور خوراک در دستگاه گوارش سبب ایجاد مسیرهای انتقالی سیگنال، به خصوص مسیر سیگنالی پروتئین کینازC می شود که در تنظیم بیان ژن موسین موثر است. مطالعات در شرایط آزمایشگاهی نشان داد که مقادیر زیاد گلوکز سبب تحریک فعالیت مسیر پروتئین کینازC در روده می شود و پروتئین کینازC به عنوان میانجی سبب افزایش بیان ژن های موسین (۲MUC وAC5MUC) میشود (اسمیرنو و همکاران، ۲۰۰۶).
فوردر و همکاران (۲۰۰۷)، طی بررسی های خود نتیجه گرفتند که سیستم ایمنی از طریق ترشح پپتیدهای آنتی میکروبیال و سیتوکین های پیش التهابی نقش مهمی در بیان mRNA پروتئین ها دارد. بررسی ها نشان میدهد که سیتوکینها سبب افزایش تولید موسین، ازدیاد سلول های گابلت و ایجاد تغییر در گلیکوزیلاسیون موسین می شوند. اندوتوکسینهای باکتریایی مانند لیپوپلی ساکاریدها، که در خارجی ترین بخش غشاء باکتری های گرم منفی وجود دارند برای بیان mRNA و ترشح سیتوکین ۸IL- و ژنهایAC5MUC و MUC5B موثر هستند. هورن و همکاران (۲۰۰۹)، به منظور بررسی تاثیر میزان ترئونین جیره بر دینامیک موسین میزان فراوانی mRNA ژن ۲MUC را مورد مطالعه قرار دادند و مشاهده نمودند که افزایش ترئونین جیره سبب افزایش فراوانی mRNA این ژن در ۱۴ روزگی شد. این محققین طی بررسی های خود مشاهده نمودند که میزان همبستگی میان دفع موسین خام و فراوانی mRNA ژن ۲MUC در گونههای مختلف پرندگان می تواند متفاوت باشد. بررسی های هورن و همکاران (۲۰۰۹)، نشان داد که در جوجهها، همبستگی ضعیفی میان دفع موسین خام و فراوانی mRNA ژن ۲MUC وجود دارد این در حالی است که در اردک ها همبستگی شدیدی میان این دو صفت وجود دارد به طوری که با افزایش فراوانی mRNA ژن ۲MUC میزان دفع موسین خام در اردکها افزایش مییابد. همچنین این محققین طی بررسی های خود مشاهده نمودند که کاهش ترئونین جیره سبب کاهش میزان نسخه برداری ژن ۲MUC در اردک ها طی ۱۴ روزگی شد و این محققین حدس زدند که تغییر در ترشح موسین تحت تاثیر ترئونین جیره احتمالا در مرحله ترجمه اتفاق میافتد.
۲-۳-واکنش رونویسی معکوسRT-PCR
واکنش رونویسی معکوس[۴۸] به ساخت DNA ‏از رویmRNA ‏الگو به کمک آنزیم نسخه بردار معکوس گفته میشود.آنزیم نسخه بردار معکوس یکDNA ‏پلیمراز وابسته به RNAاست که از خانواده ‏رتروویروسها ‏استخراج میشود. چون این DNA بطور مکمل از RNA ساخته شده است به آن cDNA[49] میگویند.
در فرآیند سنتزcDNA ‏، بسته به نوع واکنش میتوان از سه نوع آغازگر استفاده نمود:
‏۱) آغازگر ژنومیک(اختصاصی ژن)
‏۲) راندوم هگزامر
‏۳) Oligo-dT
آغازگر ژنومیک به طور اختصاصی طراحی شده و باژن خاصی هیبرید میشود اما آغازگر عمومی مانند پرایمر تصادفی هگزا نوکلئوتیدی یا ‏به طور تصادفی به تمام نقاط RNA‏ها متصل میشود، در حالی که Oligo-dTها فقط به دم پلی A متصل میشوند. در جریان تبدیلRNA ‏به cDNA ‏آنزیمRNasinمورداستفاده قرار میگیرد. این آنزیم از تجزیهRNA ‏به وسیلهRNase ‏ممانعت به عمل میآورد (اورلندو و همکاران، ۲۰۰۲).
۲-۳-۱-تکنیک Real Time PCR
PCR روشی است برای یک برنامهی دورهای مشتمل بر چرخههای حرارتی که قطعهی مورد نظر DNA به کمک آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به گرما و یک جفت پرایمر تحت تکثیر انتخابی قرار میگیرد و از طریق این روش قطعه DNA به صورت تصاعدی زیاد میشود. کاربرد بیشتر و دقیقتر تکنیک PCR در تشخیص روشهای تغییر یافتهای که از آن به وجود آمده است. یکی از روش های آن Real_ Time RT_ PCR میباشد. این تکنیک کاربردهای وسیعی در تشخیص بالینی و تحقیقات دارد. در این روش می توان یک توالی خاص را در DNAی هدف، جستجو و شناسایی کرد و همچنین مقدار آن را در نمونههای مورد مطالعه اندازه گیری نمود. پس از تکثیر DNA در هر سیکل غلظت دقیق آن اندازه گیری میشود، به این معنی که در زمان واقعی[۵۰] تولید محصول را گزارش میدهد. این روش جایگزین مناسبی برای سایر اشکال PCRکمی است زیرا در این روش میتوان مقدار کمی از ماده اولیهی یک نمونهی الگو را به صورتی بسیار اختصاصی، حساس و با قابلیت تکرار بالا، اندازه گرفت. در حالی که در روشهایPCR کمی مرسوم تولید محصول را فقط در پایان کار می توان تشخیص داد (اورلندو و همکاران، ۱۹۹۸).
در تکنیک Real_time PCR، برای تعیین غلظت DNA از رنگهای فلورسانس و یا شاخصهای الیگونوکلوتیدی استفاده میشود.
۲-۳-۱-۱-روشهای مختلف Real-Time PCR
۲-۳-۱-۱-۱- SYBR Green I
این روش سادهترین و ارزانترین روش انجام تکنیک Real-Time PCR است. رنگ SYBR Green I توانایی اتصال به شیار بزرگ[۵۱] DNA دو رشتهای را دارد و پس از اتصال، قدرت ساطع کردن فلورسانس در آن افزایش مییابد. این رنگ در محلول به علت ارتعاش بخشهای آروماتیک انرژی حاصل از برانگیخته شدن الکترونها را به بصورت انرژی گرمایی هدر میدهد، که پس از اتصال به شیار کوچک DNA چرخش حول متیل ۲ محدود شده و شروع به پرتو افشانی فلورسانسی میکند، با افزایش تعداد سیکلهای PCR ‏تعداد DNA ‏دو رشتهای نیز افزایش مییابد. این امر باعث افزایش اتصال رنگ SYBR Green I ‏به DNA ‏دو رشتهای شده که در نتیجه، افزایش ساطع شدن فلورسانس را به همراه دارد. افزایش فلورسانس در مرحله پلیمریزه شدن اتفاق میافتد. به عبارتی حداکثر فلورسانس در پایان مرحله پلیمریزه شدن و حداقل آن در ‏مرحله واسرشت است. فلورسانس ساطع شده ‏بوسیله دستگاه‏ قابل شناسایی و اندازهگیری است (وانگ و همکاران، ۲۰۰۵).
شکل۲-۱: Real-Time PCR با استفاده از رنگ سایبرگرین
از مزایای استفاده از سایبرگرین می توان به کاربرد آسان، ارزان بودن و عدم نیاز به طراحی پروب اشاره کرد، عیب این روش اختصاصیت پایین آن است، به این ترتیب که رنگ SYBR Green I ‏به طور اختصاصی به DNA ‏دو رشتهای هدف متصل نمیشود بلکه که اجازه میدهد تمامی فراوردههای غیر اختصاصیPCR مثل دایمر پرایمرها نیز پرتوی فلورسانت ساطع کرده و بنابراین میزان نمونه را به نادرستی بیش از میزان واقعی گزارش دهند. برای رفع اشکال مذکور میتوان از منحنی دمای ذوب[۵۲] استفاد ‏کرد. از آنجایی که دمای ذوب محصولات PCR ‏با طول توالیهای مختلف، متفاوت است، لذا با استفاده ‏از منحنی دمای ذوب میتوان DNA ‏دو رشتهای هدف را شناسایی کرد (گیبسون و همکاران، ۱۹۹۶). یکی دیگر از جنبههای کاربرد رنگهای باند شونده بهDNA اتصال چندین رنگ به یک ملکول تکثیر شده میباشد، پی آمد اتصال چندین رنگ به یک رشته DNA این است که در پروبها، اختصاصی به ازای هر ملکول DNA یک پیام فلورسانت فرستاده میشود، اما در استفاده از سایبرگرین میزان پیام فلورسانت ساطع شده متناسب با طول محصولDNA دو رشتهای میباشد که این امر حساسیت شناسایی فراوردههای تکثیر را افزایش میدهد (لیواک و همکاران، ۱۹۹۵؛ گیولیتیل و همکاران، ۲۰۰۱).
۲-۳-۱-۱-۲- پروبهای هیدرولیزی
در این روش از پروبهای مرسوم به پروب TaqMan ‏یا پروبهای اولیگونوکلوتیدی دارای دو ‏رنگ[۵۳] استفاده ‏میشود. پروب در انتهای ‘۵ ‏توسط ماده ‏فلورسانت گزارشگر[۵۴] و در انتهای ‘۳ ‏توسط ‏ماده فلورسانت خاموش کننده[۵۵] نشان دار میشود. در این روش از خاصیت اگزونوکلئازی آنریم Taq ‏پلیمراز استفاده میشود. اساس کار به این شکل است که تا هنگامی که پروب سالم و ‏دست نخورده است به دلیل نزدیکی گزارشگر به خاموش کننده و با استفاده از انتقال انرژی رزوناس ‏فلورسانس[۵۶] (FRET‏) از ساطع شدن فلورسانس فلوروکروم گزارشگر جلوگیری میشود. هنگام تکثیر ‏توالی هدف و در مرحله پلیمریزاسیون، پروب بوسیله آنزیم Taq ‏پلیمراز از DNA ‏جدا شده و به واسطه فعالیت اگزونوکلئازی ´۳”´۵ ‏آنزیم Taq ‏پلیمراز، هیدرولیز میشود. با هیدرولیز پروب، فلوروکروم گزارشگر و خاموش کننده از یکدیگر جدا میشوند. جدایی دو فلوروکروم از هم، موجب میشود فلورسانس گزارشگر ساطع و در نتیجه قابل شناسایی شود. به واسطه هر سیکل PCR، ملکولهای بیشتری از فلوروکروم گزارشگر جدا میشوند و میزان فلورسانس پس از انجام هر سیکل موفق PCR ‏افزایش مییابد. فلورسانس ساطع شده بوسیله دستگاه قابل شناسایی و اندازهگیری است (کاپلین و همکاران، ۱۹۹۹).
شکل ۲-۲: Real-Time PCR با استفاده از پروبهای هیدرولیزی
لازم به ذکر است محل اتصال پروبها نباید با آغازگرها همپوشانی داشته باشد وانتهای ‘۵ پروبهای Taqman نباید حاوی گوانین باشد چرا که چنین چیدمانهایی، خاصیت پوشانندگی بر روی رنگ فلورسانس گزارشگر را حتی پس از برش دارد. آزمایش Taqman از SYBRGreen اختصاصی تر و گرانتر بوده و نمودار ذوب را نمیتوان به راحتی بررسی نمود (ویل هلم و همکاران، ۲۰۰۳).
۲-۳-۱-۱-۳- پروبهای هیبریداسیونی[۵۷]
در این روش از دو پروب اختصاصی مربوط به توالی هدف استفاده میشود. هر دو پروب با ماده ‏فلورسانت نشاندار شدهاند (پروب اول در انتهای´۳ ‏با فلوروکروم دهنده[۵۸] مثلا FAM ‏و پروب دوم در‏ انتهای´۵ ‏با فلوروکروم گیرنده[۵۹] مثلا ۷۰۵ LC Red ‏یا ۶۴۰ LC Red ‏نشاندار میشوند). پروبها به توالی‏های مجاور هم در DNA ‏تکثیر شده متصل میشوند. اتصال پروبها به توالی هدف در DNA ‏تکثیر شده سبب میشود که دو پروب به فاصله ۵ ‏- ۱ ‏نوکلئوتیدی از هم قرار بگیرند. ‏این امر موجب میشود فلورکروم دهنده برانگیخته شود و نور را با طول موج بلندتر ساطع کند. به واسطه انتقال انرژی رزونانس فلورسنس فلوروکروم پذیرنده نیز برانگیخته شده و فلورسانس قابل ‏شناسایی برای دستگاه ساطع میشود. فلورسانس ساطع شده در مرحله اتصال پروب و ابتدای ‏مرحله پلیمریزاسیون شناسایی میشود. با افزایش سیکلهای موفق PCR ‏میزان اتصال پروب افزایش مییابد که این امر به افزایش فلورسانس ساطع شده منجر میشود (کاپلین و همکاران، ۱۹۹۹؛ گیبسون و همکاران، ۱۹۹۶).
شکل ۲-۳: Real-Time PCR با استفاده از پروبهای هیبریداسیونی
۲-۳-۱-۱-۴- پروبهای سنجاق سری[۶۰]
در این روش، مطابق دیگر روشهای گفته شده از یک توالی الیگونوکلئوتیدی مکمل با بخشی از توالیDNA هدف که دارای یک رنگ فلورسانت و یک رنگ خاموش کننده است، استفاده میشود. این توالی الیگونوکلئوتیدی به گونهای طراحی میگردد که چند نوکلئوتید در انتهای’۵ ‏و’۳ ‏آن مکمل یکدیگر باشند و ایجاد ساختار سنجاق سری کنند. در این حالت دو رنگ فلورسانت و خاموش کننده در کنار یکدیگر قرار میگیرند و در نتیجه اثر FRET طول موج تابش شده توسط رنگ فلورسانت به وسیله خاموش کننده جذب میشود. در مرحله اتصال پروب، این پروب به DNA ‏هدف متصل میشود و دو رنگ از یکدیگر دور میگردند و در نتیجه، اثر FRET ‏از بین رفته و نور تابش شده از رنگ فلورسانت توسط دستگاه گزارش میشود. درطول PCR، پروب Molecular Beacon ‏دست نخورده باقی میماند و تنها در هر سیکل واکنش PCR ‏به توالی هدف اتصال مییابد (اورلندو و همکاران ، ۲۰۰۲).
شکل ۲-۴: Real-Time PCR با استفاده از پروبهای سنجاق سری
۲-۳-۱-۲-مفاهیم PCR Real–Time
۲-۳-۱-۲-۱-نمودار تکثیر
نمودار تکثیر نموداری است که از رسم شدت فلورسانت ثبت شده ‏توسط دستگاه ‏در هر سیکل به دست میآید. این نمودار به شکل سیگموئید بوده ‏و دارای چهار قسمت است (دوراک، ۲۰۰۶).
۱- حالت پایه[۶۱]: زمانی که شدت فلورست تولید شده به حدی نیست که توسط ‏دستگاه ‏قابل آشکار سازی باشد.
۲- فاز لگاریتمی[۶۲]: زمانی که تکثیر، در بیشترین حالت خود میباشد، یعنی در هر سیکل در این فاز، از هر یک نسخه الگو، دو نسخه تولید میشود.
۳- فاز خطی[۶۳]: تکثیر از حالت بیشیه خارج میشود.
۴- فاز کفه[۶۴]‏: تکثیر در هر سیکل به کمترین مقدار خود میرسد.
۲-۳-۱-۲-۲-فلورسانس آستانه[۶۵]
بر اساس شدت فلورسانس زمینه معمولاً بین سیکل ۱۵ ‏- ۳ ‏آستانهای برای فلورسانس اختصاصی تعیین میشود که از این Cut off ‏به عنوان Crossing line ‏نام برد ‏میشود (دوراک، ۲۰۰۶).
۲-۳-۱-۲-۳- سیکل آستانه[۶۶]
سیکلی از PCR ‏که فلورسانس اختصاصی برای اولین بار از Crossing Line ‏میگذرد. در واقع هر چه rossmg Point ‏c پائین تر باشد تعداد نسخه هدف بیشتر است (دوراک، ۲۰۰۶).
شکل ۲-۵: نمودار تکثیر
۲-۳-۱-۲-۴- منحنی استاندارد
برای محاسبه کمی تعداد کپی ژن هدف از منحنی استاندارد[۶۷] استفاده ‏میشود. بدین منظور رقت‏های متوالی[۶۸] از ژن مورد نظر را تهیه میکنیم. بر روی رقتهای تهیه شده Real-Time PCR ‏ انجام میدهیم. با انجام Real-Time PCR ‏مقادیر سیکل آستانه ‏رقتهای مختلف بدست میآید. ‏با استفاده از دو فاکتور رقت و سیکل آستانه ‏نمودار استاندارد تهیه میکنیم. با انجام Real-Time PCR ‏برای نمونههای مجهول و بدست آوردن سیکل آستانه‏های آنها میتوان رقت نمونه مجهول را با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه کرد. عملاً هر چه غلظت بیشتر باشد، (Ct) ‏پائینتر است (دوراک، ۲۰۰۶؛ هوگت و همکاران، ۲۰۰۵).
شکل ۲-۶: منحنی استاندارد
۲-۳-۱-۲-۵- منحنی ذوب
از جمله خصوصیات و مزایای Real time PCR ترسیم منحنی ذوب است که این عمل پس از اتمام فرآیند PCR انجام میشود. دمای ذوب DNA ‏یک پارامتر ویژه برای این مو لکول میباشد و به ساختمان DNA ‏و عواملی نظیر طول و تعداد نوکلثوتیدها، میزان نمک محیط و درصد GC بستگی دارد. از آنجایی که SYBR Green I ‏نمیتواند بین محصولات مختلف تفاوتی قائل باشد، میتوان با استفاده از منحنی ذوب تنوع محصولات را در فرآیند PCR مشخص کرد. با توجه به منحنی ذوب برای هر سه آغازگر میتوان گفت آغازگرها بصورت اختصاصی عمل کردهاند و یک نمونه منفرد را از cDNA تکثیر نمودهاند، عدم وجود پیک اضافی کوچکتر از پیک محصولات که نشانگر عدم وجود پرایمر دایمر میباشد و آغازگرها تقابلی با هم ندارند. و واکنش دارای بازدهی مناسبی برای تعیین کمیت بیان ژن میباشد.
 
شکل ۲-۷: منحنی ذوب یک واکنش PCR که آغازگرها اثر متقابل دارند. پرایمر دایمر به وضوح مشاهده می شود.

منبع فایل کامل این پایان نامه این سایت pipaf.ir است