دسته بندي علمی – پژوهشی : بررسی تاثیر سطوح تغذیه ای اسانس سنبل کوهی و مرزن جوش بر بیان …

۴-۲- نتایج بیان ژن
۴-۲-۱-استخراج RNA
نتایج نورسنجی با دستگاه اسپکتوفتومتری نانودراپ نشان داد که RNA استخراج شده از بافت روده طیور دارای کیفیت و کمیت مناسبی است. در شکل ۴-۱ نمودار جذب نوری مربوط به RNA استخراج شده نمایش داده شده است.
 
شکل ۴-۱: کمیت وکیفیت RNA استخراجی از بافت روده
پروتئینها متداولترین آلوده کنندههای اضافی در نمونههای DNA و RNA می‌باشند که نور فرابنفش را در دوطول موج۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر جذب می‌کنند. همچنین بقایای فنلی و الکلی که از منابع آلوده کنندهی بیولوژی برای نمونههای DNA و RNA محسوب میشوند قادر به جذب طول موج ۲۳۰ نانومتر میباشند. لذا با محاسبه جذب نوری نمونه اسید نوکلئیک در طول موجهای ۲۳۰ ، ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر و محاسبه نسبتهای جذب ۲۸۰/۲۶۰ و ۲۳۰/۲۶۰ می‌توان خلوص اسیدهای نوکلئیک را مشخص نمود. به طور ایده‌آل نسبت OD260 به OD280 که برآوردی از نسبت اسیدهای نوکلئیک به پروتئینها در نمونه است و درجه خلوص RNA را مشخص می‌نماید. این نسبت برای RNA خالص تقریباً برابر با ۸/۱ تا ۲ میباشد. در صورتی که کمتر از این مقدار باشد مقدار اسید نوکلئیک بسیار کمتر از آن خواهد بود که بتوان با آن کار کرد کمیت و کیفیت RNA استخراجی توسط دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ Thermo تعیین شد. در مورد نمونه استخراج شده از بافت کبد نسبت به دست آمده برابر با ۹۶/۱ بود، که این نتایج حاکی از خلوص بالا و عدم وجود آلوده کنندهای فنلی و الکلی میباشد.
۴-۲-۲-سنتز cDNA
پس از ساخت cDNA برای اطمینان از نتایج کار، غلظت cDNAهای سنتز شده را با استفاده از نانودراپ تعیین شد. نتایج نورسنجی cDNAهای ساخته شده از RNA استخراجی بافت روده نشان داد که cDNAها از کمیت و کیفیت مناسبی برخوردار هستند.در زیر نمودار جذب نوری مربوط به cDNAها آمده است.
 
شکل ۴-۲: کمیت وکیفیت cDNA سنتز شده از RNA استخراجی از بافت روده
۴-۲-۳-ارزیابی و رقیق سازی و همسان سازی غلظت cDNA:
پس از تعیین کمیت و کیفیت cDNA سنتز شده از نمونههای روده با نانودراپ برای انجام Real time PCR باید تمام cDNAها را رقیق شده وبه یک غلظت مشخص رسانده شود که در این مطالعه تمام cDNAها رقیق شد و به غلظت حدود ۳۰۰ ng/µl رسید و سپس غلظت cDNAها توسط نانودراپ تایید شد.
 
شکل ۴-۳: کمیت وکیفیت cDNA رقیق شده
۴-۲-۴-دمای بهینه اتصال پرایمرهای اختصاصی ژن
به منظور تعیین دمای بهینه اتصال پرایمرهای اختصاصی ژن، یک واکنش PCR با شیب دمایی مختلف انجام شد. با توجه به این که ژن Muc2 و GAPDH بهترین باند را در دمای ˚C60 نشان دادند این دما برای اتصال پرایمرها انتخاب شد.
۴-۲-۵-منحنی ذوب
از جمله خصوصیات و مزایای Real time PCR ترسیم منحنی ذوب است که این عمل پس از اتمام فرآیند PCR انجام میشود. دمای ذوب DNA ‏یک پارامتر ویژه برای این مولکول میباشد و به ساختمان DNA ‏و عواملی نظیر طول و تعداد نوکلئوتیدها، میزان نمک محیط و درصد GC بستگی دارد. از آنجایی که SYBR Green I ‏نمیتواند بین محصولات مختلف تفاوتی قائل شود، میتوان با استفاده از منحنی ذوب تنوع محصولات را در فرآیند PCR مشخص کرد. لذا با استفاده از قابلیت دستگاه (Applied Biosystems 7300) در حضور مخلوط اصلی اقدام به رسم یک شیب دمایی Real time PCR شد. این آزمون برای ژنهای Muc2 و GAPDH در طیف حرارتی ۶۰ درجه سانتیگراد اندازه گیری شد. بالاترینrRn و کمترین CT ملاک انتخاب دمای بهینه اتصال آغازگرها می باشد. بر این اساس دمای ۶۰ درجه سانتیگراد برای ژنها انتخاب شدند. برای ژنهای به کار برده شده دمای Tm برابر شد با ۶۰ درجه سانتیگراد با توجه به منحنی ذوب برای آغازگرها میتوان گفت که آغازگرها بصورت اختصاصی عمل کردهاند و یک نمونه منفرد را از cDNA تکثیر نمودهاند، همانطور که در شکل دیده میشود پیک اضافی کوچکتر از پیک محصولات که نشانگر وجود پرایمر دایمر میباشد، وجود ندارد و این نشانگر این موضوع است که آغازگرها تقابلی با هم ندارند. از آنجا که پرایمر دایمرها قطعات کوچکتری نسبت به محصول اصلی تولید میکنند بنابراین دمای ذوب پایینتری نسبت به محصول اصلی دارند در نتیجه منحنی ذوب پرایمر دایمرها کوچکتر و قبل از منحنی ذوب محصول اصلی میباشد. در صورتی که محصولی بصورت غیر اختصاصی تکثیر شود که دمای ذوب آن بالاتر از محصول اصلی باشد منحنی ذوب بعد از منحنی ذوب محصول اصلی دیده میشود. منحنی ذوب مناسب دارای ویژگیهایی نظیر کشیده و نوک تیز بودن می باشد و همچنین منحنی ذوب تکرارهای یک نمونه کاملا بر روی هم قرار میگیرند که در تصویر زیر این ویژگیها بخوبی مشاهده می شود.
شکل ۴-۴: منحی ذوب محصولات ژن GAPDH
شکل ۴-۵: منحی ذوب محصولات ژن Muc2
۴-۲-۶-بیان ژن Muc2
نتایج بررسی بیان ژنهای GAPDH و Muc2نشان داد که مقدار بیان ژن Muc2 در بین تیمارهای مختلف اخلاف معنی داری وجود ندارد. با توجه به اینکه در این آزمایش سطوح مختلف پروبیوتیک، آنتی بیوتیک، سنبل کوهی و مرزن جوش مورد بررسی قرار گرفت و برای بیان نسبی ژن نیاز به گروه کنترل بود، لذا جیره پایه(شاهد)به عنوان معیار سنجش بیان ژن قرار گرفت. همانطور که در جدول ۴-۳دیده میشود بیان ژن ۲Muc در سطوح مختلف تیمارها اختلاف معنی داری را نشان نداد(۰۵/۰>P) اما میزان بیان ژن ۲Muc در تیمارهای سطوح مختلف سنبل کوهی، مرزن جوش و پروبیوتیک نسبت به گروه شاهد افزایش یافته است. به طوری که کمترین بیان مربوط به گروه آنتی بیوتیک و بالاترین بیان مربوط به مرزن جوش(۴۰۰) می باشد. شکل ۴-۶ منحنی تکثیر واکنش

دانلود متن کامل این پایان نامه در سایت abisho.ir