تحقيق دانشگاهی – بررسی تاثیر سطوح تغذیه ای اسانس سنبل کوهی و مرزن جوش بر بیان ژن موسین در …

’’۳۰

۶۰

اتصال آغازگرها

’’۳۰

۷۲

بسط آغاز گرها

جدول ۳-۹- چرخه دمایی آنالیز منحنی ذوب

زمان دما
’’۱۵ ۹۵
‘۱ ۶۰
’’۳۰ ۹۵
’’۱۵ ۶۰

۳-۳-۱۳-رسم منحنی ذوب
رسم منحنی ذوب به وسیله اندازهگیری تغییرات فلورسانس در زمانهای مختلف صورت میگیرد (واند سمپل، ۲۰۰۲). مراحل انجام کار به این ترتیب است که برای رسم منحنی، دستگاه دمای نمونهها را در فواصل زمانی مشخص (مثلا هر ۱۰ ‏ثانیه) به مقدار معینی تغییرداد. به طور مثال ابتدا دستگاه دمای نمونهها را به ۹۴ ‏درجه سانتیگراد رساند. در این حالت تمام DNA ‏ها به صورت تک رشتهای هستند و میزان SYBR Green ‏متصل شده حداقل است. در نتیجه میزان فلورسانس ساطع شده کم میباشد. به تدریج دستگاه دمای نمونهها را ۵/۰ درجه سانتیگراد کاهش داده و ۱۰ ثانیه در آن دما ثابت میماند و در این مدت نور ساطع شده از نمونهها توسط دستگاه اندازه گیری میشود. همزمان با این عمل، منحنی تغییرات فلورسانس برحسب دما که همان منحنی ذوب است ترسیم میگردد. در نقطه ذوب ۵۰ درصد از پیوندهای هیدروژنی در DNAهای دو رشتهای از هم جدا میشوند و میزان فلورسانس به طور ناگهانی تغییر مییابد. در این منحنی هر یک از peak ها نمایانگر Tm یک محصول pcr است، بنابراین با آنالیز منحنی ذوب می توان وجود باندهای غیر اختصاصی و پرایمر دایمر را تشخیص داد. نرم افزار، سرعت تغییرات را بصورت RFU (Relative Fluorescence Unite) در محور y و دمای دستگاه را در محور x نشان می دهد.
۳-۳-۱۴-محاسبه بیان نسبی ژن Muc2
پس از بررسی و تحلیل مراحل فوق مقادیر مربوط به چرخه آستانه (Ct) حاصل از تکرارهای بیولوژی و تکنیکی هر تیمار برای محاسبه میزان بیان نسبی ژن Muc2 در بافت روده مورد مطالعه، وارد نرم افزار Excel گردید. میانگین CT، برای تکرارهای تکنیکی ژن Muc2 و ژن GAPDH محاسبه شد. سپس با استفاده از رابطه ذیل میزان CT∆، تعیین گردید:
CT (Refrence) – CT ( Target ) = CT
CT (GAPDH) – CT (Muc2) = CT
۳-۴- مدل آماری طرح
آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با ۷ تیمار انجام شد. تیمار یک به عنوان تیمار شاهد در نظر گرفته شد. در طول دوره ی آزمایش صفات تولیدی مانند وزن زنده(گرم)، افزایش وزن روزانه(گرم)، مورد بررسی قرار گرفت. داده های جمع آوری شده با استفاده از نرم افزار SAS با مدل طرح کاملا تصادفی رویه عمومی خطی(GLM) مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و برای مقایسه میانگین ها از آزمون چند دامنه دانکن استفاده شد، مدل آماری طرح به شرح زیر بود.
Yij = µ + Ti + eij
Yij : میزان بیان ژن Muc2در بافت روده

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت zusa.ir مراجعه نمایید.